Q，问题

A, 可能的原因和建议的解决方案

没有提取到质粒DNA或得率低

a) 培养方面: 溶氧量的问题，培养总体积不要过大，一般为培养瓶的20%体积，使用透气性好的封瓶膜，转数200rpm~250rpm。注意杂菌生长问题，菌落是否正常生长，抗生素不可忽略，培养基的PH=7.2 ，培养时间8~16H , 温控在37°。

b) OD值对质粒提取至关重要：最佳性能提取及最佳吸光值，细胞数量保持OD值=3~5，可选择自然过夜培养的菌液，稀释十倍，或自行稀释最佳性能的OD值。

c) 菌量较多，不完全裂解：过多的细胞数会导致裂解及中和的不完全，直观表现为：①加P2后液相浑浊，不清澈透明；②加P3中和，离心后液相浑浊，中和不彻底，过滤注射器会堵塞。③加质粒结合液后液相浑浊，核酸结合柱会堵塞。影响得率以及浓度；(不同的菌种的生长条件，对碱性裂解敏感性有所不同，可适当调整裂解条件)

d) 不完全中和，P3的重要性：中和状态不应该是糊状及结团状，应该是蓬松，应是质地较轻漂浮到液面顶端，冰上孵育体系辅助中和，中和完全可有效去除基因组DNA，并提高得率，过得菌量并不能带来更多的质粒DNA并且会造成提取过程当中不必要的麻烦.

.P3加入后，中和离心后所剩液相体积与质粒结合液最佳比例体积,参考第9页。

e) 质粒DNA洗涤液2：确保在质粒洗涤液2中加入了正确体积的乙醇。此外，确保每次使用后瓶盖拧紧，以防止乙醇蒸发

Q，问题

A, 可能的原因和建议的解决方案

RNA的残留

a)过多的细胞数量会导致RNA残留过多，使得Rnase A 的酶达到极值，不能消化掉更多的RNA残留。RNA残留过多影响核酸浓度值，使得数据不准确。解决办法为降低菌液量，严格按照标注的OD值进行操作，或调高Rnase A的浓度（菌种本身RNA含量高）。

b)P1中的Rnase A 降解，Rnase A溶解在P1后，确保P1长期存储在4°C，随用随取。。如果确定溶液P1中的RNase A失活，在溶液P1中补加RNase A（终浓度≥100µg/ml）即可；RNase A可以单独购买。

内毒素量超标

过多的细胞数量会导致内毒素过多，使得内毒素去除柱的能力达到极值，不能去除更多的内毒素量，解决办法为更换一个全新的内毒素去除柱重复过柱一次。

质粒DNA电泳质量

a)电泳点样孔异常亮：质粒中污染了细菌基因组DNA , 多是由于P2加入后震荡过于剧烈，导致基因组DNA剪切或放置时间过长导致的

b) 质粒DNA条带下方500bp左右有条带或者荧光团的存在

为RNA残留，需调整参与提取的菌液浓度，或者调整Rnase A 的浓度；

电泳条带不完整，涣散，不干净

前两孔为杂菌DNA污染，裂解不充分，洗涤液性能衰退。

后两孔为正常质粒提取，浓度及纯度达到性能标准，条带完整无基因组DNA和RNA污染，无降解。