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实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。
定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR)是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中,总RNA或信使RNA(mRNA)首先通过逆转录酶转录成互补DNA(cDNA)。随后,以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中,其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。
RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起,使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中,逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成,使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。
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优点 | 缺点 |
一步法 |
1、由于两步反应都在一个管中完成,因此该方法具有更少的实验误差 2、更少的移液步骤能够减少污染的风险 3、适用于高通量扩增/筛选,快速且可重现性高 |
1、无法分别对两步反应进行优化 2.由于反应条件是结合两步反应折衷得到的,因此灵敏性不如两步法 3、单一样品检测的靶点数较少 |
两步法 |
1、能够建立可以长期保存,并用于多次反应的稳定的CDNA库 2、靶基因和内参基因能够从同一个cDNA库进行扩增而不需要多重cDNA库 3、能够优化单一反应过程的反应缓冲液和反应条件 4、灵活的引发条件选择 |
1、使用多个试管,以及更多的移液步骤会增加DNA污染的风险,并且耗时。 2、相较于一步法,需要进行更多的优化 |
简石生物一步荧光定量PCR试剂盒·产品特点
高检测灵敏度:可检测到个位数拷贝的模板或 0.1pg 的总 RNA。
多重检测:支持多重探针检测。
抗污染体系:使用的是 dUTP/UNG 防污染体系,不含 dTTP,能有效消除扩增产物的污染。
本产品适用于人源、病毒、细菌 RNA 或者体外转录 RNA 等的定量或定性检测。
使用简石生物一步法RT-qPCR试剂与厂家A及厂家B的RT-qPCR试剂进行对比:底物模板分别为RNA及cDNA,相同底物模板情况下,简石试剂Cq值最小,且误差值最低,证明简石RT-qPCR试剂性能最优,且稳定性最好可重复最高!
针
使用简石一步法RT-qPCR试剂对不同浓度RNA底物模板进行检测,结果表明:简石试剂可对低至0.01ng/μl的RNA模板进行检出,具有及高的检测灵敏度,可适用于各种低载量RNA病毒的检测,更符合目前的病毒检测试剂盒要求。
【预期用途】
用于唾液、口腔、鼻腔不集后的样本的预处理,使样本中的核酸(DNA 和RNA)释放出来。以便于使用体外诊断试剂或仪器对待测物进行检测。
【检测原理】
核酸释放剂可以快速破坏蛋白结构,并清除样本中的核酸酶,保证核酸的有效释放。
无需提取,可直接进行检测!
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